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Journal of Digestive Cancer Research 2022; 10(2): 82-91

Published online December 1, 2022

https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

© Korean Society of Gastrointestinal Cancer Research

오가노이드를 활용한 약물 검색 플랫폼

Drug Discovery Platform Using Organoids

맹주은1,2,3, 김순찬2,3,4, 송명현1,2,3, 정나현2,3, 구자록1,2,3,4
Ju Eun Maeng1,2,3 , Soon-Chan Kim2,3,4 , Myoung-Hyun Song1,2,3 , Nahyun Jeong2,3 , Ja-Lok Ku1,2,3,4


1서울대학교 의과대학 의과학과, 2서울대학교 의과대학 암연구소 세포생물학연구실, 3서울대학교 의과대학 암연구소 한국세포주은행, 4서울대학교 의과대학 허혈저산소질환연구소
1Department of Biomedical Sciences, Seoul National University College of Medicine, 2Laboratory of Cell Biology, Cancer Research Institute, Seoul National University, 3Korean Cell Line Bank, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine, 4Ischemic/Hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Correspondence to :
Ja-Lok Ku
E-mail: kujalok@snu.ac.kr
https://orcid.org/0000-0002-7090-537X

Received: November 8, 2022; Revised: November 22, 2022; Accepted: November 22, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Gastrointestinal cancer accounts for one-third of the overall cancer occurrence worldwide. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a type of gastrointestinal cancer that is known to be one of the most fatal among all cancer types, with a 5-year survival rate of less than 8%. Chemotherapy combined with surgical resection is its probable curative option. However, surgery is accessible for only 10–15% of patients diagnosed with PDAC. Organoids show self-organizing capacities and resemble the original tissue in terms of morphology and function. Organoids can also be cultured with high effectiveness from tumor tissues derived from each patient, making them an extremely fitting model for translational uses and improving personalized cancer medicine. Enhancing drug screening platforms is necessary to apply personalized medicine-based organoids in clinical settings.

KeywordsPancreatic neoplasm Gastrointestinal neoplasms Organoids Drug evaluation High-throughput nucleotide sequencing

전세계 암 발병률 및 사망률의 약 3분의 1이 gastrointestinal cancer와 관련이 있다[1]. 그 중에서도 췌관선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 모든 암 유형 중에서 가장 공격적이고 치명적인 암 중의 하나로, 5년 생존율이 8% 미만이다[2]. PDAC에 대한 유일한 완치 방법인 수술은 PDAC 진단을 받은 환자의 10–15%에서만 가능하다[3]. 췌장암은 말기에 진단받기 때문에 생존율이 낮으며 따라서 PDAC를 치료하는 새로운 방법이 중요하다[4].

오가노이드(organoid)는 형태와 기능 면에서 원래 조직과 유사하고 자가 조직화 능력이 있으며, 조직, 만능 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포에서 자란 미세한 three-dimensional (3D) 구조다. 환자 유래 종양 및 이 종양에 상응하는 정상 조직에서 유래한 오가노이드는 전세계적으로 여러 연구 집단에서 배양되고 있다. 또한 계대 배양, 증식과 함께 액체질소에 동결보존하는 바이오뱅킹 과정을 거치고 있다. 이러한 오가노이드 바이오뱅크는 오가노이드가 개별 환자의 약물 반응에 대한 예측 가치를 보유하는지 발견하는 데 적용될 수 있다. 약물 반응성의 차이가 있는 유전자 마커를 적용하는데 필요한 통계가 유의미하기 위해서는, 다양하고 많은 종류의 오가노이드를 바이오뱅크에 보존하는 것이 필수적이다[5]. 환자 유래 오가노이드를 기반으로 한 개인 맞춤형 의료가 임상에 적용되기 위해서는 민감도와 견고성 측면에서 약물 스크리닝 플랫폼의 개선이 필요하며[6], 향후에는 암 발병에 기여하는 분자 경로를 표적으로 하기 위해 암 환자에서 유래한 오가노이드를 활용할 경우 개인 맞춤 약물 스크리닝과 암 치료의 개선에 도움이 될 것으로 여겨진다. 본 리뷰는 “Novel Drug Screening Platform: Tumor Organoid”의 내용 대부분을 참고해서 작성하였다[7].

오가노이드 수립

오가노이드는 시험관 내에서 생성되는 작은 자가 재생 3D 구조이며, 오가노이드가 유래한 기관과 기능적으로나 구조적으로 많은 유사점을 보여준다. 오가노이드를 활용할 경우 개인 맞춤 치료 환경에서 약물 반응의 정확한 예측이 가능할 것으로 판단된다[8]. Fig. 1은 오가노이드가 체외 연구 모델로 다양하게 활용되는 것을 보여주고 있다.

Fig. 1.Applications of organoids (figure created with BioRender.com).

환자에서 유래한 조직을 효소나 기계적으로 작은 조각으로 분절한 다음 기질 속에 넣어 오가노이드를 생성한다. 3D 오가노이드를 생성하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포외 기질(extracellular matrix)은 콜라겐과 Matrigel (Corning, Corning, NY, USA)이다. 미세 환경 내에서 상피 세포를 둘러싸고 있는 간질 세포(mesenchymal cell)에서 유래한 신호를 제공하기 위해서는 분화 조절제와 다양한 성장 인자가 필수적이다. 예를 들어, FGF 10 (유사분열촉진), Rspo1 (Wnt 신호전달 강화), Noggin (bone morphogenetic protein [BMP] 신호전달 억제), Wnt3a, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, 가스트린 및 A83-01 (Alk 억제제)이 필요하다. 또한, 정상적인 인간 3D 오가노이드의 경우 prostaglandin E2가 필요하다[9]. 암 환자 유래 오가노이드 모델은 종양 생검 또는 외과적 수술에서 절제된 종양 조직이나 인근의 정상 조직으로 생성할 수 있다[10-12].

환자 유래 세포를 배양하여 세포주나 오가노이드를 수립할 수 있으며, 전통적인 two-dimensional (2D) 세포주 배양과는 달리 오가노이드 배양이 더 효율적이다[6]. 그 결과, 오가노이드 배양이 시작된 지 10여년도 안된 상황에서도 보다 다양한 장기에서 많은 종류의 환자 유래 오가노이드(patient-derived organoid, PDO)가 수립되었으며, 이를 기반으로 비영리 및 영리기관들에서 오가노이드 바이오뱅크가 수립되고 있다. 이렇게 수립된 오가노이드는 중개연구 문제를 해결하고 종양의 특성을 체외에서 복제하는 데 사용할 수 있다[13]. 오가노이드는 어느 정도 영구적으로 계대배양이 되고 냉동 보존될 수 있기 때문에 종양 형성의 각 단계를 연구하는데 있어서도 실질적으로 활용될 수 있으며, 순수한 정상세포나 암세포를 활용하여 전사체, 유전자, 단백질체 및 생화학적 분석이 가능하다[4].

PDO는 오가노이드가 유래한 원발 조직의 형태학적 특징을 유지하며, 오가노이드 배양으로 특정 성장 인자를 사용하여 종양 특이적 유전적 변화가 있는 세포를 분류하거나 오가노이드 배양 시 억제제를 처리하여 오가노이드를 제어할 수 있다. 환자 종양 유래 오가노이드를 배양할 때 가장 조심스럽게 다뤄야 할 문제는 종양 샘플의 세균이나 곰팡이, 효모 등의 오염이며, 배지에 적절한 항생제, 항진균제 등을 첨가하여 이러한 다양한 종류의 미생물의 오염을 제어해야 한다[13].

오가노이드의 응용

기초연구에서 췌장암 오가노이드

오가노이드 배양 기술은 원래는 종양화 되지 않은 건강한 조직을 연구하는 데 사용되었으며, 그 이후로 이러한 오가노이드 배양 시스템은 PDAC 모델을 포함하여 종양을 연구하는 데 사용되고 있다[14].

대규모 그룹 분석에서 PDAC 오가노이드 모델을 채택하여 오가노이드를 수립한 성공률은 fine-needle biopsy와 절제된 종양 조직 간에 매우 유사했다(> 70%). 따라서, PDAC의 모든 단계에서 오가노이드 모델을 생성할 수 있다[15,16].

수립된 췌장암 오가노이드는 췌장암 원발 조직의 여러 병리학적 특징을 반영하기 때문에 췌장암 연구의 강력한 도구로 사용될 수 있다. 암 환자 유래 조직에서 짧은 시간 안에 수립된 췌장암 오가노이드는 췌장암의 바이오마커의 약물 스크리닝 및 진단 평가에 이용할 수 있다. 오가노이드는 수술 샘플, 생검 샘플, 또는 fine-needle aspiration (FNA)에서 배양할 수 있기 때문에 이 기술로 다양한 암 단계 및 임상 조건에서 실험이 가능하다[10]. 췌장암 오가노이드는 각각 다른 형태학적인 특징을 나타낸다. Fig. 2는 SNU-6831-TO와 SNU-6390-TO의 광학 현미경 사진이며, SNU-6831-TO는 내강이 깨끗한 낭포성(cystic) 구조이며 SNU-6390-TO는 내강이 채워진(compact) 구조이다.

Fig. 2.Brightfield microscopy images of pancreatic cancer organoids. Bar indicates 500 μm.

Anne Grapin-Botton과 Hans Clevers 그룹은 모두 정상 마우스 췌장세포를 Matrigel 안에서 배양하는 오가노이드 배양 방법을 확립했다[17,18]. Grapin-Botton과 동료들은 췌관을 형성하기 위해 Matrigel 내부에서 마우스 배아 췌장 세포를 배양하였다[17]. 이러한 배아 유래 췌장 오가노이드는 배양할 경우 빠르게 성장하고 분화하였다. Clevers 그룹은 Grapin-Botton과 다른 접근 방식을 사용했는데, 이들은 이전 연구를 바탕으로 성체 마우스의 췌관 세포를 사용하여 오가노이드를 수립하였다[18]. 즉, 췌관 세포를 여러 성장 인자들과 serum-free Matrigel 속에 넣어 배양할 경우 빠르게 성장하는 pancreatic duct cells을 형성함을 확인하였다.

이러한 방법은 외과적으로 절제된 인체 PDAC 종양에서 높은 효율로 췌장암 오가노이드를 성장시키기 위해 Muthuswamy 그룹에 의해 활용되었다[19]. 인체 PDAC 오가노이드는 내강이 차있는 구형으로 성장하고 이형성 형태를 나타낸다. 생쥐에 이식된 오가노이드는 원래의 종양을 반영하는 선암종으로 발전하였으며, 더욱이, 오가노이드는 냉동보존이 가능하고 지속적으로 계대 배양이 될 수 있다. 인체유래의 PDAC 오가노이드를 배양할 경우, 원발성 종양과 유사한 다양한 병리조직 소견을 관찰할 수 있다. 따라서 이러한 오가노이드 배양 시스템에서 원발성 종양에서 관찰되는 종양내 이질성을 관찰할 수 있음을 시사한다[4].

Kuo 연구실은 stromal support cell과 같은 필수 성장 인자와 air-liquid interface을 사용하는 배양 시스템을 개발했다[20]. 이는 기존에 조직 특이적 성장 인자를 포함하는 배지를 사용하는 일반적인 배양 시스템과는 달랐다. 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 또한 오가노이드를 배양하는데 사용할 수 있다[21].

암 조직에서 유래한 환자 오가노이드는 췌장 미세 환경을 매우 잘 모방하며, 연구적인 면에서는 만능 줄기 세포(PSC) 유래 오가노이드보다 더 많이 개발되었다. 그럼에도 불구하고, PSC의 다능적 특성과 필요한 인자를 생성하는 미세 환경을 고려할때, PSC에서 배양된 오가노이드는 성장 인자 첨가제가 덜 필요하다.

공동 배양 방법 및 암관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 아형

췌장 성상 세포(stellate cell)와 췌장암 3D 오가노이드의 공배양 모델은 Ohlund 등[22]에 의해 확립되었으며, 공배양할 경우, 섬유아세포와 오가노이드가 빠르게 증식하는 것을 발견했다. 또한, CAF 간에 이질성을 나타내는 다양한 수준의 interleukin-6 및 smooth muscle actin을 발견했다. 이러한 특성은 오가노이드와 유사한 기능을 나타내며, 이러한 결과는 기질의 복잡성과 상피 종양 형성(tumorigenesis)에서의 중요성을 보여준다[22].

췌장 성상 세포와 췌장암 오가노이드의 공배양으로 췌장 CAF 아형들과 interleukin-6가 분비되어 오가노이드의 증식에 도움을 주는 여러 인자들이 발견 되었다[22]. PDO-CAF 공배양과 추가 연구에 의해 확인된 특징적인 CAF 아형들의 생화학적 경로로 인해서 종양에서의 CAF 형성 방법을 확립하였다[23]. 연구자들과 임상의들은 해당 환자들에게서 유래한 강력한 공배양 시스템으로 임상 적용 전에 수많은 면역 요법 전략을 평가할 수 있을 것으로 생각된다[24].

현재 PDAC 치료에서 PDAC의 낮은 면역원성 때문에 면역치료제(immunotherapy)의 개발에 주요 제한 문제들이 나타난다. PDAC의 발달 전반에 걸쳐, 암의 타고난 공격적인 특성은 면역원성과 및 면역 활성화 결핍과 관련될 수 있다. 그럼에도 불구하고 몸의 면역 체계는 자연살상세포(natural killer cells), cytotoxic T cells 및 T helper cells를 비롯한 다양한 기능을 가진 면역 세포들이 존재하기 때문에 PDAC의 면역 저하를 극복하기 위한 방법이 미래에 제시될 수 있다[24].

대장암 오가노이드의 활용

종양 내 이질성은 약물 반응의 저항성에 관여하여 결장 직장암 치료의 효율을 저해한다. 본 연구실에서는 12명의 환자로부터 단일 종양의 여러 영역에서 분리된 세포주와 오가노이드를 수립하였고, 오가노이드와 세포주 모델을 사용하여 전장엑솜서열분석(whole exome sequencing, WES) 및 RNA 서열분석(RNA sequencing)을 수행하였다. 또한, 수립된 오가노이드와 세포주 모델을 사용하여 임상적으로 사용 가능한 24개의 항암화합물에 대해서 약물 반응을 측정하였다. 이를 통하여 12명의 환자 모두에서 종양의 영역에 따른 다양한 분자 이질성을 발견하였고, 같은 환자 유래 종양 영역에서도 각 부위마다 약물 반응에 차이가 남을 증명하였다. 특히, 분자표적이 같은 항암제라도 작용 기전에 따라서 단일 종양 내 여러 부위에서 수립한 오가노이드들에 대해 다른 반응성을 보이는 것을 발견하였다. 또한 세포주/오가노이드 소재와 next generation sequencing (NGS)/항암제 데이터의 연계를 통하여 단일 생검 기반 임상 진단은 다양한 아형 클론으로 이루어진 암종을 치료하기에 적합하지 않은 것을 제시하였고, 이를 극복하기 위해서는 다양한 유전자 인자와 전사체 및 단백질 이질성의 포괄적인 통합과 병행하여 모든 암 아형 클론이 공유하는 돌연변이를 표적화하는 것이 중요한 것을 제시하였다[25].

동시성 암(synchronous cancer)은 초기 진단 시 단일 환자의 동일하거나 다른 장기에서 발견된 2개 이상의 원발성 종양으로 정의된다. 장관에서 확인된 다발성 원발성 암의 발병률은 극히 드물며 환자 유래 오가노이드 및 세포주를 사용하여 이러한 동시성 종양에서 종양 형성은 아직 연구되지 않았다. 본 연구에서는 대장뿐만 아니라 단일 환자의 장 트랙의 다른 영역에서 분리된 종양에서 6개의 PDO, 세포주(patient-derived cell line, PDC) 및 PDO 유래 세포주(organoid-derived cell lines, PDOC) 세트를 수립하였고, 이러한 동시성 소장 및 대장암(synchronous intestinal cancer) 모델을 이용하여 게놈, 전사체, 후성 유전학 및 약리학적 분석을 진행하였다 수립된 PDO, PDOC 및 PDC가 개별 환자의 장관 전체에 걸쳐 동시성 대장암의 조직병리학적 및 분자적 이질성을 요약한다는 것을 입증하였다. 전사체 및 후성 유전적 변화가 소장과 대장의 장기 특성을 초월하는 종양의 진행 패턴을 관찰하였다. 뿐만 아니라 동시성 대장암 모델에서 약물 반응성을 확인함으로써 분자적 이질성과 종양 간 독립적인 클론(clone)의 특성과 서브클론(subclone)간의 연관성을 확인하였다. 이러한 유전체, 후성 유전체와 약물 반응성을 통합하는 멀티 오믹스 데이터는 동시성 대장암 모델의 분자적 특성과 약물 반응 간의 상관 관계를 밝혀냄으로써 동시성 암 환자에게 적절한 환자 맞춤형 치료 표적을 제시할 수 있다[26].

인접한 4개의 대장암 조직을 통해 오가노이드를 수립하고, 초기 계대 수에서 각각의 single clone들을 미세조작기(micromanipulator)로 분리하여 한 환자로부터 총 19개의 오가노이드 주를 수립하게 되었다. 이를 통해 환자의 종양 조직간, 조직 내 세포간 종양이질성을 동시에 분석하고자 하였으며, 이미지기반 고효율 처리시스템을 통한 항암제 감수성, 오가노이드 성장패턴에서 통계적으로 유효한 이질성이 확인되었다. 또한, WES 및 RNA 분석으로 오가노이드간 돌연변이 패턴과 암유발유전자(cancer-driver gene)의 이질성이 존재하는 것을 확인하였다. 추가로, single clone을 이용한 이미지 기반 항암제 실시간 스크리닝은 적은 시료로도 빠르게 분석을 가능하게 하며, 이질성으로부터 유래한 종양 조직 내 항암제내성 인자를 조기에 발견할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 시간대별로 항암제 반응성을 측정하기 때문에 종점(end-point)에서 같은 세포사멸률을 보이더라도, 더 빠른시간 내 세포를 효율적으로 사멸시키는 환자 맞춤 항암제를 발견하여 환자의 항암제 투약기간을 줄이는데에도 기여할 수 있을 것이다[27].

Fig. 3는 대장암 오가노이드의 형태를 공초점현미경(confocal microscopy)으로 세포를 시각화한 것을 보여준다. 빨간색은 세포 골격인 액틴(actin filament)을 염색하는 phalloidin이며, Diamidino-2-phenylindole는 DNA에 결합하며 파란색을 띠고, CD133은 대장암 줄기세포 표지자이다.

Fig. 3.Confocal microscopy images of colorectal cancer organoid. Red, phalloidin; Blue, diamidino-2-phenylindole; Green, CD-133. Bar indicates 100 μm.

오가노이드를 이용한 정밀 의학

외과적으로 절제된 췌장 조직에서 신속하게 수립할 수 있는 췌장암 오가노이드는 인간 췌장암을 표현하는 3D 모델이다[10]. 오가노이드는 화학요법 내성과 연관될것으로 생각되는 기질 구성 성분뿐만 아니라 환자의 종양을 모방한다[10,28]. 많은 양의 종양 조직이 필요하고 숙주의 장기에서 형성되는 데 수개월이 걸릴 수 있는 patient derived xenograft와는 달리, 인체 PDAC 오가노이드는 더 적은 재료로 신속하게 제작될 수 있다[29]. 따라서, 환자 유래 오가노이드를 활용하여 가능한 치료 표적을 조사함으로써 오가노이드를 맞춤형 암 치료에 사용할 수 있을것으로 판단된다.

작은 biopsy 샘플로 제작이 가능한 PDAC의 ex-vivo 모델인 췌관 오가노이드를 사용하여 진행성 및 전이성 환자의 연구가 가능하며, 오가노이드 모델을 이용한 췌장암 연구는 정밀 의학 적용을 위해 고무적이다[14].

오가노이드에는 환자의 driver mutation 및 chromosomal copy number와 같은 질병의 유전적 특성이 유지기 때문에 오가노이드는 환자 특이적 분석을 위한 표준 모델을 제공한다[30]. 췌장암은 종종 내시경 초음파 유도 FNA와 같은 샘검으로 발견되며, 오가노이드는 다른 배양 기술과 달리 성공 확률이 높아서 한 번의 바늘 통과로 채취된 생검 조직으로부터 생성할 수 있다[10]. Fine needle biopsy에서 배양된 PDAC 오가노이드는 화학 요법 전에 종양에서 조직을 채취할 수 있을 수 있어 췌장 종양 자체에 대해 보다 일반적인 이해를 제공한다. 오가노이드 모델은 다른 연구에서 간과되었던 PDAC 환자의 생체 외 치료 테스트 및 유전체 특성분석 가능성을 보여준다. PDAC 오가노이드는 계대배양이 가능하고 유전체 분석이 가능하며 배양이 된 후 몇 주 이내에 승인된 표준 치료 요법으로 테스트할 수 있다. 이러한 점은 환자에게 제공되는 오가노이드 기반치료제 선택을 가능하게 한다[4].

오가노이드를 활용한 약물 스크리닝

PDAC 환자에 대한 임상 요법을 적용하기 전 또는 적용하는 동안에 암환자 유래 오가노이드는 짧은 시간안에 독립적으로 종양의 약물 테스트를 위한 플랫폼을 제공할 수 있다. 환자의 생검을 받은 후 3–4주 내에 대규모 약물 스크리닝을 수행할 수 있었던 반면에, 일부 그룹에서는 생검에서 약물 선택까지의 기간이 1주일이 소요되었다[31].

2D 암 세포주를 이용한 약물 스크리닝이 약물 반응의 유전적 추측에 대한 주요 통찰력을 제공했음에도 불구하고[32], 2D 세포주가 세포주가 유래한 종양 조직의 특성을 그대로 반영하지 못하는 특성으로 인해 임상 시험에서 새로운 약물 발견의 실패 요인이 되었다[33]. 환자 유래 종양 오가노이드는 인체 종양을 잘 재현하기 때문에 새로운 항암제의 진단 및 테스트를 더 잘 나타낼 수 있다. 환자 유래 오가노이드를 이용한 신속 대량 약물 스크리닝(high-throughput drug screening) 기술이 확장되기 시작했으며, 지금까지 소규모 약물 스크리닝을 수행한 오가노이드 바이오뱅크는 좋은 결과를 보여주고 있다[6].

췌장암 환자에서 수립된 종양 오가노이드를 활용한 항암제 테스트 절차를 소개하면 다음과 같다. 본 연구실에서는 췌장 오가노이드의 약물 민감도를 테스트하기 위해 TryPLE 시약을 사용하여 basement membrane extract (BME) dome을 기계적으로 용해한다. 6–9 ml의 TryPLE을 BME에 포함된 오가노이드에 추가하고 15 ml conical tube로 옮긴다. 튜브를 37℃ 항온 수조에서 15분 동안 놓아둔다. Conical tube를 원심분리하고 상층액을 완전히 흡인한다. Human pancreatic culture medium (HPCM)와 BME 겔을 1 : 1 비율로 혼합한다. 60 μl의 용액을 12 channel multipipette을 사용하여 96-well plate의 각 well에 추가한다. 약 30분 후, 20 μl HPCM을 각 well에 추가한다. 96시간 후, well에서 배양된 오가노이드에 약물이 적용된다.

Fig. 4는 오가노이드의 여러 drug result가 drug response 및 subtype으로 clustering이 되는 예시를 보여준다. 이러한 clustering 방법으로 오가노이드에 따라 반응하는 약물의 차이를 확인할 수 있고 오가노이드와 약물의 비교 분석이 가능하다.

Fig. 4.Visualization of drug screen results of organoids.

여러가지 항암제나 화함물들에 대한 오가노이드 반응을 나타내는 pharmacotyping은 화학 요법에 대한 환자의 반응성과 상응한다. 오가노이드의 high-throughput drug screening을 위해서는 3D 배양이 가능하도록 새로운 자동화 방법의 수립 또는 기존 자동화 시스템에 대한 3D 배양 기술의 조정이 필요하다[34].

환자 유래 오가노이드의 고속대량검색은 다양한 치료제에 대한 민감도를 나타내며, 동일한 생물학적 절차 또는 분자 경로를 표적으로 하는 요인에 의해 유사한 반응이 발견되었다. 연구 진행이 된 많은 PDO 중, 다른 PDO에 비해 특정 PDO에서 더 반응성이 높았던 약물을 구별할 수 있었으며, 종종 발견되는 대부분의 효율적인 약물은 동일한 분자 경로를 목표로 하는 약물들이었다. 여러 사항을 고려했을 때, 이러한 발견은 정확한 표적치료(targeted therapy)가 소수의 환자에게만 성공할 것이라는 이론을 뒷받침한다. 따라서 각 개별 환자에게 적합한 약물을 선택하기 위해서는 개별화된 적용이 필요하다[13].

van de Wetering과 동료들[35]은 오가노이드 바이오뱅크를 설립하였으며, 이들은 종양 및 인접 정상 오가노이드를 모두 사용하여 심화된 게놈 및 전사체 분석을 완료함으로써 종양 특이적 DNA와 RNA 차이의 유의미한 결과를 발견했다. 오가노이드가 반응하는 화합물을 확인하기 위해 치료용 화합물의 맞춤형 collection을 활용하여 종양 오가노이드들을 high-throughput 방식으로 테스트 하였다. 이 방법으로 실질적인 환자별 항암 치료제를 확인할 수 있었다. 이전에 잘 알려진 mutation based drug sensitivity는 치료 피드백과 돌연변이 위치 간의 연관성에 의해 입증되었다. 본질적으로 염기서열 분석만으로는 제안의 중요성을 강조하는 일부 치료 반응을 예측할 수 없었다[4].

현재 NGS는 췌장암 정밀 의학의 핵심 모델이다. 췌장에서 얻은 매우 적은 양의 종양 조직에서 다양한 점 돌연변이를 발견하기 위해 NGS를 이용해서 유전체의 여러 부분을 분석할 수 있다. 또한, NGS는 췌장 악성 종양과 관련된 유전자에서 발견된 돌연변이의 특정 그룹에 대한 “panel testing”을 적용할 수 있다[36,37]. 이러한 데이터는 췌장 종양의 유형에 따라 더 성공적인 것으로 알려진 항암요법절차를 선택하는데 적용될 수 있다. NGS는 질병의 전반적인 치료 가능성을 고려하는 초기 단계에 있으며 정밀 의학의 한 유형에 속한다. 오가노이드는 췌장암의 중개 연구 및 정밀 의학을 위한 강력한 기술이다. 또한, 외과적으로 절제된 종양으로 환자 유래 오가노이드를 수립할 수 있으며 환자 PDAC의 작은 삼차원적 모델로 간주할 수 있다[10]. 특히 섬유아세포와 기질로 재구성될 때, 오가노이드는 환자의 종양의 전체 범위를 모방할 수 있다[22].

암 환자를 위한 맞춤형 의료에 효과적인 암 환자 유래 오가노이드의 수립은 매우 중요하다. 오가노이드는 여러 장기에서 암 발생과 발달을 연구하는 데 사용할 수 있다. 또한, 유전적으로나 표현형 적으로 안정적이며 장기간 냉동 보존 및 계대가 가능하다. 오가노이드 기술은 신호 전달 경로와 암 관련 과정을 조사하는 데 사용할 수 있다. 약물 개발에 오가노이드 기술을 사용할 때의 중요한 이점은 정상 조직과 종양 조직에서 모두 오가노이드를 활용할 수 있다는 점이다. 이런 점은 특히 종양 세포를 선택하는 약물에 대한 스크리닝을 허용하면서 정상 세포는 손상되지 않아 항암제에 의한 환자의 독성을 감소시킬 수 있다. 오가노이드는 개별 환자 유래 종양 조직에서 높은 효율성으로 배양될 수 있으므로 이행 연구 및 개인 맞춤 치료의 개선에 매우 적합한 모델이 된다. 기초 및 중개 연구에 오가노이드 모델의 적용을 향상시키기 위해서는 많은 문제를 해결해야 한다. 예를 들어, 오가노이드 배양 비용을 줄이고, 오가노이드 성장 시간을 단축하고, 생산성을 개선하고, 원래 종양의 종양 미세 환경을 모방하는 것은 오가노이드에 대한 연구를 더욱 발전시킬 것이다. 아직 여러가지 문제점을 개선 시켜야 하지만, 오가노이드 기술은 빠르게 발전하고 있으며 이 방법이 기초 암 연구와 임상 발전에 유익한 효과를 줄 가능성은 분명하다.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Conceptualization: Ju Eun Maeng. Data acquisition: Ju Eun Maeng, Soon-Chan Kim, Myoung-Hyun Song, Nahyun Jeong. Formal analysis: Ju Eun Maeng. Funding: Ja-Lok Ku. Supervision: Ja-Lok Ku. Writing—original draft: Ju Eun Maeng. Writing—review & editing: Ju Eun Maeng, Ja-Lok Ku.

  1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018;68:394-424. Erratum in: CA Cancer J Clin 2020;70:313. https://doi.org/10.3322/caac.21492.
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Article

Review Article

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Published online December 1, 2022 https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

Copyright © Korean Society of Gastrointestinal Cancer Research.

오가노이드를 활용한 약물 검색 플랫폼

맹주은1,2,3, 김순찬2,3,4, 송명현1,2,3, 정나현2,3, 구자록1,2,3,4

1서울대학교 의과대학 의과학과, 2서울대학교 의과대학 암연구소 세포생물학연구실, 3서울대학교 의과대학 암연구소 한국세포주은행, 4서울대학교 의과대학 허혈저산소질환연구소

Received: November 8, 2022; Revised: November 22, 2022; Accepted: November 22, 2022

Drug Discovery Platform Using Organoids

Ju Eun Maeng1,2,3 , Soon-Chan Kim2,3,4 , Myoung-Hyun Song1,2,3 , Nahyun Jeong2,3 , Ja-Lok Ku1,2,3,4

1Department of Biomedical Sciences, Seoul National University College of Medicine, 2Laboratory of Cell Biology, Cancer Research Institute, Seoul National University, 3Korean Cell Line Bank, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine, 4Ischemic/Hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Correspondence to:Ja-Lok Ku
E-mail: kujalok@snu.ac.kr
https://orcid.org/0000-0002-7090-537X

Received: November 8, 2022; Revised: November 22, 2022; Accepted: November 22, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Gastrointestinal cancer accounts for one-third of the overall cancer occurrence worldwide. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a type of gastrointestinal cancer that is known to be one of the most fatal among all cancer types, with a 5-year survival rate of less than 8%. Chemotherapy combined with surgical resection is its probable curative option. However, surgery is accessible for only 10–15% of patients diagnosed with PDAC. Organoids show self-organizing capacities and resemble the original tissue in terms of morphology and function. Organoids can also be cultured with high effectiveness from tumor tissues derived from each patient, making them an extremely fitting model for translational uses and improving personalized cancer medicine. Enhancing drug screening platforms is necessary to apply personalized medicine-based organoids in clinical settings.

Keywords: Pancreatic neoplasm, Gastrointestinal neoplasms, Organoids, Drug evaluation, High-throughput nucleotide sequencing

INTRODUCTION

전세계 암 발병률 및 사망률의 약 3분의 1이 gastrointestinal cancer와 관련이 있다[1]. 그 중에서도 췌관선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 모든 암 유형 중에서 가장 공격적이고 치명적인 암 중의 하나로, 5년 생존율이 8% 미만이다[2]. PDAC에 대한 유일한 완치 방법인 수술은 PDAC 진단을 받은 환자의 10–15%에서만 가능하다[3]. 췌장암은 말기에 진단받기 때문에 생존율이 낮으며 따라서 PDAC를 치료하는 새로운 방법이 중요하다[4].

오가노이드(organoid)는 형태와 기능 면에서 원래 조직과 유사하고 자가 조직화 능력이 있으며, 조직, 만능 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포에서 자란 미세한 three-dimensional (3D) 구조다. 환자 유래 종양 및 이 종양에 상응하는 정상 조직에서 유래한 오가노이드는 전세계적으로 여러 연구 집단에서 배양되고 있다. 또한 계대 배양, 증식과 함께 액체질소에 동결보존하는 바이오뱅킹 과정을 거치고 있다. 이러한 오가노이드 바이오뱅크는 오가노이드가 개별 환자의 약물 반응에 대한 예측 가치를 보유하는지 발견하는 데 적용될 수 있다. 약물 반응성의 차이가 있는 유전자 마커를 적용하는데 필요한 통계가 유의미하기 위해서는, 다양하고 많은 종류의 오가노이드를 바이오뱅크에 보존하는 것이 필수적이다[5]. 환자 유래 오가노이드를 기반으로 한 개인 맞춤형 의료가 임상에 적용되기 위해서는 민감도와 견고성 측면에서 약물 스크리닝 플랫폼의 개선이 필요하며[6], 향후에는 암 발병에 기여하는 분자 경로를 표적으로 하기 위해 암 환자에서 유래한 오가노이드를 활용할 경우 개인 맞춤 약물 스크리닝과 암 치료의 개선에 도움이 될 것으로 여겨진다. 본 리뷰는 “Novel Drug Screening Platform: Tumor Organoid”의 내용 대부분을 참고해서 작성하였다[7].

MAIN SUBJECTS

오가노이드 수립

오가노이드는 시험관 내에서 생성되는 작은 자가 재생 3D 구조이며, 오가노이드가 유래한 기관과 기능적으로나 구조적으로 많은 유사점을 보여준다. 오가노이드를 활용할 경우 개인 맞춤 치료 환경에서 약물 반응의 정확한 예측이 가능할 것으로 판단된다[8]. Fig. 1은 오가노이드가 체외 연구 모델로 다양하게 활용되는 것을 보여주고 있다.

Figure 1. Applications of organoids (figure created with BioRender.com).

환자에서 유래한 조직을 효소나 기계적으로 작은 조각으로 분절한 다음 기질 속에 넣어 오가노이드를 생성한다. 3D 오가노이드를 생성하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포외 기질(extracellular matrix)은 콜라겐과 Matrigel (Corning, Corning, NY, USA)이다. 미세 환경 내에서 상피 세포를 둘러싸고 있는 간질 세포(mesenchymal cell)에서 유래한 신호를 제공하기 위해서는 분화 조절제와 다양한 성장 인자가 필수적이다. 예를 들어, FGF 10 (유사분열촉진), Rspo1 (Wnt 신호전달 강화), Noggin (bone morphogenetic protein [BMP] 신호전달 억제), Wnt3a, 니코틴아미드, N-아세틸시스테인, 가스트린 및 A83-01 (Alk 억제제)이 필요하다. 또한, 정상적인 인간 3D 오가노이드의 경우 prostaglandin E2가 필요하다[9]. 암 환자 유래 오가노이드 모델은 종양 생검 또는 외과적 수술에서 절제된 종양 조직이나 인근의 정상 조직으로 생성할 수 있다[10-12].

환자 유래 세포를 배양하여 세포주나 오가노이드를 수립할 수 있으며, 전통적인 two-dimensional (2D) 세포주 배양과는 달리 오가노이드 배양이 더 효율적이다[6]. 그 결과, 오가노이드 배양이 시작된 지 10여년도 안된 상황에서도 보다 다양한 장기에서 많은 종류의 환자 유래 오가노이드(patient-derived organoid, PDO)가 수립되었으며, 이를 기반으로 비영리 및 영리기관들에서 오가노이드 바이오뱅크가 수립되고 있다. 이렇게 수립된 오가노이드는 중개연구 문제를 해결하고 종양의 특성을 체외에서 복제하는 데 사용할 수 있다[13]. 오가노이드는 어느 정도 영구적으로 계대배양이 되고 냉동 보존될 수 있기 때문에 종양 형성의 각 단계를 연구하는데 있어서도 실질적으로 활용될 수 있으며, 순수한 정상세포나 암세포를 활용하여 전사체, 유전자, 단백질체 및 생화학적 분석이 가능하다[4].

PDO는 오가노이드가 유래한 원발 조직의 형태학적 특징을 유지하며, 오가노이드 배양으로 특정 성장 인자를 사용하여 종양 특이적 유전적 변화가 있는 세포를 분류하거나 오가노이드 배양 시 억제제를 처리하여 오가노이드를 제어할 수 있다. 환자 종양 유래 오가노이드를 배양할 때 가장 조심스럽게 다뤄야 할 문제는 종양 샘플의 세균이나 곰팡이, 효모 등의 오염이며, 배지에 적절한 항생제, 항진균제 등을 첨가하여 이러한 다양한 종류의 미생물의 오염을 제어해야 한다[13].

오가노이드의 응용

기초연구에서 췌장암 오가노이드

오가노이드 배양 기술은 원래는 종양화 되지 않은 건강한 조직을 연구하는 데 사용되었으며, 그 이후로 이러한 오가노이드 배양 시스템은 PDAC 모델을 포함하여 종양을 연구하는 데 사용되고 있다[14].

대규모 그룹 분석에서 PDAC 오가노이드 모델을 채택하여 오가노이드를 수립한 성공률은 fine-needle biopsy와 절제된 종양 조직 간에 매우 유사했다(> 70%). 따라서, PDAC의 모든 단계에서 오가노이드 모델을 생성할 수 있다[15,16].

수립된 췌장암 오가노이드는 췌장암 원발 조직의 여러 병리학적 특징을 반영하기 때문에 췌장암 연구의 강력한 도구로 사용될 수 있다. 암 환자 유래 조직에서 짧은 시간 안에 수립된 췌장암 오가노이드는 췌장암의 바이오마커의 약물 스크리닝 및 진단 평가에 이용할 수 있다. 오가노이드는 수술 샘플, 생검 샘플, 또는 fine-needle aspiration (FNA)에서 배양할 수 있기 때문에 이 기술로 다양한 암 단계 및 임상 조건에서 실험이 가능하다[10]. 췌장암 오가노이드는 각각 다른 형태학적인 특징을 나타낸다. Fig. 2는 SNU-6831-TO와 SNU-6390-TO의 광학 현미경 사진이며, SNU-6831-TO는 내강이 깨끗한 낭포성(cystic) 구조이며 SNU-6390-TO는 내강이 채워진(compact) 구조이다.

Figure 2. Brightfield microscopy images of pancreatic cancer organoids. Bar indicates 500 μm.

Anne Grapin-Botton과 Hans Clevers 그룹은 모두 정상 마우스 췌장세포를 Matrigel 안에서 배양하는 오가노이드 배양 방법을 확립했다[17,18]. Grapin-Botton과 동료들은 췌관을 형성하기 위해 Matrigel 내부에서 마우스 배아 췌장 세포를 배양하였다[17]. 이러한 배아 유래 췌장 오가노이드는 배양할 경우 빠르게 성장하고 분화하였다. Clevers 그룹은 Grapin-Botton과 다른 접근 방식을 사용했는데, 이들은 이전 연구를 바탕으로 성체 마우스의 췌관 세포를 사용하여 오가노이드를 수립하였다[18]. 즉, 췌관 세포를 여러 성장 인자들과 serum-free Matrigel 속에 넣어 배양할 경우 빠르게 성장하는 pancreatic duct cells을 형성함을 확인하였다.

이러한 방법은 외과적으로 절제된 인체 PDAC 종양에서 높은 효율로 췌장암 오가노이드를 성장시키기 위해 Muthuswamy 그룹에 의해 활용되었다[19]. 인체 PDAC 오가노이드는 내강이 차있는 구형으로 성장하고 이형성 형태를 나타낸다. 생쥐에 이식된 오가노이드는 원래의 종양을 반영하는 선암종으로 발전하였으며, 더욱이, 오가노이드는 냉동보존이 가능하고 지속적으로 계대 배양이 될 수 있다. 인체유래의 PDAC 오가노이드를 배양할 경우, 원발성 종양과 유사한 다양한 병리조직 소견을 관찰할 수 있다. 따라서 이러한 오가노이드 배양 시스템에서 원발성 종양에서 관찰되는 종양내 이질성을 관찰할 수 있음을 시사한다[4].

Kuo 연구실은 stromal support cell과 같은 필수 성장 인자와 air-liquid interface을 사용하는 배양 시스템을 개발했다[20]. 이는 기존에 조직 특이적 성장 인자를 포함하는 배지를 사용하는 일반적인 배양 시스템과는 달랐다. 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 또한 오가노이드를 배양하는데 사용할 수 있다[21].

암 조직에서 유래한 환자 오가노이드는 췌장 미세 환경을 매우 잘 모방하며, 연구적인 면에서는 만능 줄기 세포(PSC) 유래 오가노이드보다 더 많이 개발되었다. 그럼에도 불구하고, PSC의 다능적 특성과 필요한 인자를 생성하는 미세 환경을 고려할때, PSC에서 배양된 오가노이드는 성장 인자 첨가제가 덜 필요하다.

공동 배양 방법 및 암관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 아형

췌장 성상 세포(stellate cell)와 췌장암 3D 오가노이드의 공배양 모델은 Ohlund 등[22]에 의해 확립되었으며, 공배양할 경우, 섬유아세포와 오가노이드가 빠르게 증식하는 것을 발견했다. 또한, CAF 간에 이질성을 나타내는 다양한 수준의 interleukin-6 및 smooth muscle actin을 발견했다. 이러한 특성은 오가노이드와 유사한 기능을 나타내며, 이러한 결과는 기질의 복잡성과 상피 종양 형성(tumorigenesis)에서의 중요성을 보여준다[22].

췌장 성상 세포와 췌장암 오가노이드의 공배양으로 췌장 CAF 아형들과 interleukin-6가 분비되어 오가노이드의 증식에 도움을 주는 여러 인자들이 발견 되었다[22]. PDO-CAF 공배양과 추가 연구에 의해 확인된 특징적인 CAF 아형들의 생화학적 경로로 인해서 종양에서의 CAF 형성 방법을 확립하였다[23]. 연구자들과 임상의들은 해당 환자들에게서 유래한 강력한 공배양 시스템으로 임상 적용 전에 수많은 면역 요법 전략을 평가할 수 있을 것으로 생각된다[24].

현재 PDAC 치료에서 PDAC의 낮은 면역원성 때문에 면역치료제(immunotherapy)의 개발에 주요 제한 문제들이 나타난다. PDAC의 발달 전반에 걸쳐, 암의 타고난 공격적인 특성은 면역원성과 및 면역 활성화 결핍과 관련될 수 있다. 그럼에도 불구하고 몸의 면역 체계는 자연살상세포(natural killer cells), cytotoxic T cells 및 T helper cells를 비롯한 다양한 기능을 가진 면역 세포들이 존재하기 때문에 PDAC의 면역 저하를 극복하기 위한 방법이 미래에 제시될 수 있다[24].

대장암 오가노이드의 활용

종양 내 이질성은 약물 반응의 저항성에 관여하여 결장 직장암 치료의 효율을 저해한다. 본 연구실에서는 12명의 환자로부터 단일 종양의 여러 영역에서 분리된 세포주와 오가노이드를 수립하였고, 오가노이드와 세포주 모델을 사용하여 전장엑솜서열분석(whole exome sequencing, WES) 및 RNA 서열분석(RNA sequencing)을 수행하였다. 또한, 수립된 오가노이드와 세포주 모델을 사용하여 임상적으로 사용 가능한 24개의 항암화합물에 대해서 약물 반응을 측정하였다. 이를 통하여 12명의 환자 모두에서 종양의 영역에 따른 다양한 분자 이질성을 발견하였고, 같은 환자 유래 종양 영역에서도 각 부위마다 약물 반응에 차이가 남을 증명하였다. 특히, 분자표적이 같은 항암제라도 작용 기전에 따라서 단일 종양 내 여러 부위에서 수립한 오가노이드들에 대해 다른 반응성을 보이는 것을 발견하였다. 또한 세포주/오가노이드 소재와 next generation sequencing (NGS)/항암제 데이터의 연계를 통하여 단일 생검 기반 임상 진단은 다양한 아형 클론으로 이루어진 암종을 치료하기에 적합하지 않은 것을 제시하였고, 이를 극복하기 위해서는 다양한 유전자 인자와 전사체 및 단백질 이질성의 포괄적인 통합과 병행하여 모든 암 아형 클론이 공유하는 돌연변이를 표적화하는 것이 중요한 것을 제시하였다[25].

동시성 암(synchronous cancer)은 초기 진단 시 단일 환자의 동일하거나 다른 장기에서 발견된 2개 이상의 원발성 종양으로 정의된다. 장관에서 확인된 다발성 원발성 암의 발병률은 극히 드물며 환자 유래 오가노이드 및 세포주를 사용하여 이러한 동시성 종양에서 종양 형성은 아직 연구되지 않았다. 본 연구에서는 대장뿐만 아니라 단일 환자의 장 트랙의 다른 영역에서 분리된 종양에서 6개의 PDO, 세포주(patient-derived cell line, PDC) 및 PDO 유래 세포주(organoid-derived cell lines, PDOC) 세트를 수립하였고, 이러한 동시성 소장 및 대장암(synchronous intestinal cancer) 모델을 이용하여 게놈, 전사체, 후성 유전학 및 약리학적 분석을 진행하였다 수립된 PDO, PDOC 및 PDC가 개별 환자의 장관 전체에 걸쳐 동시성 대장암의 조직병리학적 및 분자적 이질성을 요약한다는 것을 입증하였다. 전사체 및 후성 유전적 변화가 소장과 대장의 장기 특성을 초월하는 종양의 진행 패턴을 관찰하였다. 뿐만 아니라 동시성 대장암 모델에서 약물 반응성을 확인함으로써 분자적 이질성과 종양 간 독립적인 클론(clone)의 특성과 서브클론(subclone)간의 연관성을 확인하였다. 이러한 유전체, 후성 유전체와 약물 반응성을 통합하는 멀티 오믹스 데이터는 동시성 대장암 모델의 분자적 특성과 약물 반응 간의 상관 관계를 밝혀냄으로써 동시성 암 환자에게 적절한 환자 맞춤형 치료 표적을 제시할 수 있다[26].

인접한 4개의 대장암 조직을 통해 오가노이드를 수립하고, 초기 계대 수에서 각각의 single clone들을 미세조작기(micromanipulator)로 분리하여 한 환자로부터 총 19개의 오가노이드 주를 수립하게 되었다. 이를 통해 환자의 종양 조직간, 조직 내 세포간 종양이질성을 동시에 분석하고자 하였으며, 이미지기반 고효율 처리시스템을 통한 항암제 감수성, 오가노이드 성장패턴에서 통계적으로 유효한 이질성이 확인되었다. 또한, WES 및 RNA 분석으로 오가노이드간 돌연변이 패턴과 암유발유전자(cancer-driver gene)의 이질성이 존재하는 것을 확인하였다. 추가로, single clone을 이용한 이미지 기반 항암제 실시간 스크리닝은 적은 시료로도 빠르게 분석을 가능하게 하며, 이질성으로부터 유래한 종양 조직 내 항암제내성 인자를 조기에 발견할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 시간대별로 항암제 반응성을 측정하기 때문에 종점(end-point)에서 같은 세포사멸률을 보이더라도, 더 빠른시간 내 세포를 효율적으로 사멸시키는 환자 맞춤 항암제를 발견하여 환자의 항암제 투약기간을 줄이는데에도 기여할 수 있을 것이다[27].

Fig. 3는 대장암 오가노이드의 형태를 공초점현미경(confocal microscopy)으로 세포를 시각화한 것을 보여준다. 빨간색은 세포 골격인 액틴(actin filament)을 염색하는 phalloidin이며, Diamidino-2-phenylindole는 DNA에 결합하며 파란색을 띠고, CD133은 대장암 줄기세포 표지자이다.

Figure 3. Confocal microscopy images of colorectal cancer organoid. Red, phalloidin; Blue, diamidino-2-phenylindole; Green, CD-133. Bar indicates 100 μm.

오가노이드를 이용한 정밀 의학

외과적으로 절제된 췌장 조직에서 신속하게 수립할 수 있는 췌장암 오가노이드는 인간 췌장암을 표현하는 3D 모델이다[10]. 오가노이드는 화학요법 내성과 연관될것으로 생각되는 기질 구성 성분뿐만 아니라 환자의 종양을 모방한다[10,28]. 많은 양의 종양 조직이 필요하고 숙주의 장기에서 형성되는 데 수개월이 걸릴 수 있는 patient derived xenograft와는 달리, 인체 PDAC 오가노이드는 더 적은 재료로 신속하게 제작될 수 있다[29]. 따라서, 환자 유래 오가노이드를 활용하여 가능한 치료 표적을 조사함으로써 오가노이드를 맞춤형 암 치료에 사용할 수 있을것으로 판단된다.

작은 biopsy 샘플로 제작이 가능한 PDAC의 ex-vivo 모델인 췌관 오가노이드를 사용하여 진행성 및 전이성 환자의 연구가 가능하며, 오가노이드 모델을 이용한 췌장암 연구는 정밀 의학 적용을 위해 고무적이다[14].

오가노이드에는 환자의 driver mutation 및 chromosomal copy number와 같은 질병의 유전적 특성이 유지기 때문에 오가노이드는 환자 특이적 분석을 위한 표준 모델을 제공한다[30]. 췌장암은 종종 내시경 초음파 유도 FNA와 같은 샘검으로 발견되며, 오가노이드는 다른 배양 기술과 달리 성공 확률이 높아서 한 번의 바늘 통과로 채취된 생검 조직으로부터 생성할 수 있다[10]. Fine needle biopsy에서 배양된 PDAC 오가노이드는 화학 요법 전에 종양에서 조직을 채취할 수 있을 수 있어 췌장 종양 자체에 대해 보다 일반적인 이해를 제공한다. 오가노이드 모델은 다른 연구에서 간과되었던 PDAC 환자의 생체 외 치료 테스트 및 유전체 특성분석 가능성을 보여준다. PDAC 오가노이드는 계대배양이 가능하고 유전체 분석이 가능하며 배양이 된 후 몇 주 이내에 승인된 표준 치료 요법으로 테스트할 수 있다. 이러한 점은 환자에게 제공되는 오가노이드 기반치료제 선택을 가능하게 한다[4].

오가노이드를 활용한 약물 스크리닝

PDAC 환자에 대한 임상 요법을 적용하기 전 또는 적용하는 동안에 암환자 유래 오가노이드는 짧은 시간안에 독립적으로 종양의 약물 테스트를 위한 플랫폼을 제공할 수 있다. 환자의 생검을 받은 후 3–4주 내에 대규모 약물 스크리닝을 수행할 수 있었던 반면에, 일부 그룹에서는 생검에서 약물 선택까지의 기간이 1주일이 소요되었다[31].

2D 암 세포주를 이용한 약물 스크리닝이 약물 반응의 유전적 추측에 대한 주요 통찰력을 제공했음에도 불구하고[32], 2D 세포주가 세포주가 유래한 종양 조직의 특성을 그대로 반영하지 못하는 특성으로 인해 임상 시험에서 새로운 약물 발견의 실패 요인이 되었다[33]. 환자 유래 종양 오가노이드는 인체 종양을 잘 재현하기 때문에 새로운 항암제의 진단 및 테스트를 더 잘 나타낼 수 있다. 환자 유래 오가노이드를 이용한 신속 대량 약물 스크리닝(high-throughput drug screening) 기술이 확장되기 시작했으며, 지금까지 소규모 약물 스크리닝을 수행한 오가노이드 바이오뱅크는 좋은 결과를 보여주고 있다[6].

췌장암 환자에서 수립된 종양 오가노이드를 활용한 항암제 테스트 절차를 소개하면 다음과 같다. 본 연구실에서는 췌장 오가노이드의 약물 민감도를 테스트하기 위해 TryPLE 시약을 사용하여 basement membrane extract (BME) dome을 기계적으로 용해한다. 6–9 ml의 TryPLE을 BME에 포함된 오가노이드에 추가하고 15 ml conical tube로 옮긴다. 튜브를 37℃ 항온 수조에서 15분 동안 놓아둔다. Conical tube를 원심분리하고 상층액을 완전히 흡인한다. Human pancreatic culture medium (HPCM)와 BME 겔을 1 : 1 비율로 혼합한다. 60 μl의 용액을 12 channel multipipette을 사용하여 96-well plate의 각 well에 추가한다. 약 30분 후, 20 μl HPCM을 각 well에 추가한다. 96시간 후, well에서 배양된 오가노이드에 약물이 적용된다.

Fig. 4는 오가노이드의 여러 drug result가 drug response 및 subtype으로 clustering이 되는 예시를 보여준다. 이러한 clustering 방법으로 오가노이드에 따라 반응하는 약물의 차이를 확인할 수 있고 오가노이드와 약물의 비교 분석이 가능하다.

Figure 4. Visualization of drug screen results of organoids.

여러가지 항암제나 화함물들에 대한 오가노이드 반응을 나타내는 pharmacotyping은 화학 요법에 대한 환자의 반응성과 상응한다. 오가노이드의 high-throughput drug screening을 위해서는 3D 배양이 가능하도록 새로운 자동화 방법의 수립 또는 기존 자동화 시스템에 대한 3D 배양 기술의 조정이 필요하다[34].

환자 유래 오가노이드의 고속대량검색은 다양한 치료제에 대한 민감도를 나타내며, 동일한 생물학적 절차 또는 분자 경로를 표적으로 하는 요인에 의해 유사한 반응이 발견되었다. 연구 진행이 된 많은 PDO 중, 다른 PDO에 비해 특정 PDO에서 더 반응성이 높았던 약물을 구별할 수 있었으며, 종종 발견되는 대부분의 효율적인 약물은 동일한 분자 경로를 목표로 하는 약물들이었다. 여러 사항을 고려했을 때, 이러한 발견은 정확한 표적치료(targeted therapy)가 소수의 환자에게만 성공할 것이라는 이론을 뒷받침한다. 따라서 각 개별 환자에게 적합한 약물을 선택하기 위해서는 개별화된 적용이 필요하다[13].

van de Wetering과 동료들[35]은 오가노이드 바이오뱅크를 설립하였으며, 이들은 종양 및 인접 정상 오가노이드를 모두 사용하여 심화된 게놈 및 전사체 분석을 완료함으로써 종양 특이적 DNA와 RNA 차이의 유의미한 결과를 발견했다. 오가노이드가 반응하는 화합물을 확인하기 위해 치료용 화합물의 맞춤형 collection을 활용하여 종양 오가노이드들을 high-throughput 방식으로 테스트 하였다. 이 방법으로 실질적인 환자별 항암 치료제를 확인할 수 있었다. 이전에 잘 알려진 mutation based drug sensitivity는 치료 피드백과 돌연변이 위치 간의 연관성에 의해 입증되었다. 본질적으로 염기서열 분석만으로는 제안의 중요성을 강조하는 일부 치료 반응을 예측할 수 없었다[4].

현재 NGS는 췌장암 정밀 의학의 핵심 모델이다. 췌장에서 얻은 매우 적은 양의 종양 조직에서 다양한 점 돌연변이를 발견하기 위해 NGS를 이용해서 유전체의 여러 부분을 분석할 수 있다. 또한, NGS는 췌장 악성 종양과 관련된 유전자에서 발견된 돌연변이의 특정 그룹에 대한 “panel testing”을 적용할 수 있다[36,37]. 이러한 데이터는 췌장 종양의 유형에 따라 더 성공적인 것으로 알려진 항암요법절차를 선택하는데 적용될 수 있다. NGS는 질병의 전반적인 치료 가능성을 고려하는 초기 단계에 있으며 정밀 의학의 한 유형에 속한다. 오가노이드는 췌장암의 중개 연구 및 정밀 의학을 위한 강력한 기술이다. 또한, 외과적으로 절제된 종양으로 환자 유래 오가노이드를 수립할 수 있으며 환자 PDAC의 작은 삼차원적 모델로 간주할 수 있다[10]. 특히 섬유아세포와 기질로 재구성될 때, 오가노이드는 환자의 종양의 전체 범위를 모방할 수 있다[22].

CONCLUSION

암 환자를 위한 맞춤형 의료에 효과적인 암 환자 유래 오가노이드의 수립은 매우 중요하다. 오가노이드는 여러 장기에서 암 발생과 발달을 연구하는 데 사용할 수 있다. 또한, 유전적으로나 표현형 적으로 안정적이며 장기간 냉동 보존 및 계대가 가능하다. 오가노이드 기술은 신호 전달 경로와 암 관련 과정을 조사하는 데 사용할 수 있다. 약물 개발에 오가노이드 기술을 사용할 때의 중요한 이점은 정상 조직과 종양 조직에서 모두 오가노이드를 활용할 수 있다는 점이다. 이런 점은 특히 종양 세포를 선택하는 약물에 대한 스크리닝을 허용하면서 정상 세포는 손상되지 않아 항암제에 의한 환자의 독성을 감소시킬 수 있다. 오가노이드는 개별 환자 유래 종양 조직에서 높은 효율성으로 배양될 수 있으므로 이행 연구 및 개인 맞춤 치료의 개선에 매우 적합한 모델이 된다. 기초 및 중개 연구에 오가노이드 모델의 적용을 향상시키기 위해서는 많은 문제를 해결해야 한다. 예를 들어, 오가노이드 배양 비용을 줄이고, 오가노이드 성장 시간을 단축하고, 생산성을 개선하고, 원래 종양의 종양 미세 환경을 모방하는 것은 오가노이드에 대한 연구를 더욱 발전시킬 것이다. 아직 여러가지 문제점을 개선 시켜야 하지만, 오가노이드 기술은 빠르게 발전하고 있으며 이 방법이 기초 암 연구와 임상 발전에 유익한 효과를 줄 가능성은 분명하다.

FUNDING

None.

CONFLICTS OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

AUTHOR’S CONTRIBUTIONS

Conceptualization: Ju Eun Maeng. Data acquisition: Ju Eun Maeng, Soon-Chan Kim, Myoung-Hyun Song, Nahyun Jeong. Formal analysis: Ju Eun Maeng. Funding: Ja-Lok Ku. Supervision: Ja-Lok Ku. Writing—original draft: Ju Eun Maeng. Writing—review & editing: Ju Eun Maeng, Ja-Lok Ku.

Fig 1.

Figure 1.Applications of organoids (figure created with BioRender.com).
Journal of Digestive Cancer Research 2022; 10: 82-91https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

Fig 2.

Figure 2.Brightfield microscopy images of pancreatic cancer organoids. Bar indicates 500 μm.
Journal of Digestive Cancer Research 2022; 10: 82-91https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

Fig 3.

Figure 3.Confocal microscopy images of colorectal cancer organoid. Red, phalloidin; Blue, diamidino-2-phenylindole; Green, CD-133. Bar indicates 100 μm.
Journal of Digestive Cancer Research 2022; 10: 82-91https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

Fig 4.

Figure 4.Visualization of drug screen results of organoids.
Journal of Digestive Cancer Research 2022; 10: 82-91https://doi.org/10.52927/jdcr.2022.10.2.82

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JDCR
Vol.12 No.1
April 20, 2024
eISSN : 2950-9505
pISSN : 2950-9394
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